次要农做物种子中若何快速、准确、高效筛查转基因成分？
来源：中国种业 做者：张海波 等
农做物种子的选育，分为天然留种、遗传育种和分子育种等几个阶段，目前农做物种子次要通过遗传育种的体例选育。转基因手艺做为新型分子育种手艺，为农做物的遗传改进供给了宽广的前景。全球转基因做物的贸易化种植面积，在2019年已经到达了1.904亿hm²，1996-2019年转基因做物的累计种植面积已经到达27亿hm²。
我国农做物种子市场浩荡，为使种子量量逐年进步，种子监管必不成少。农做物种子的监管包罗尝试室研究、品种审定、企业加工、市场营销、种植和进出口等环节，通过那些环节的监管，产生的转基因检测样品十分多。为了进步检测效率、降低检测成本，急需科学高效的转基因筛查检测办法，为转基因成分的政府监管供给有力的手艺支持。
目前转基因成分分子检测办法有卵白量检测和核酸检测两大类。以PCR手艺为根底的转基因产物检测根据其特异性的差别能够分红3类，包罗筛查检测法（Screening PCR）、基因特异性检测法（Gene-specific PCR）和转化体特异性检测法（Event-specific PCR）。筛查法是针对转基因产物中通用元件的检测，包罗启动子、末行子或标识表记标帜基因等元件，如CaMV 35S启动子、NOS末行子等。该办法的原理是，起首统计阐发已经贸易化的转基因做物的转化体外源基因和元件插进序列情状，其次是抉择利用频次高而且能够笼盖全数已知转基因转化体的起码数外源元件做为检测对象。有此中的任何一个元件检出为阳性，则表白该样品中可能含有转基因成分。若检测的每个元件的成果都为阴性，则阐明该样品中未检出已知贸易化的转基因做物的成分。差别农做物的贸易化转化体差别，其所用基因元件的品种和频次也差别，每个做物需根据详细转化体的情状，摘取差别的筛查战略停止筛查检测。本文以我国五大次要农做物玉米、水稻、小麦、大豆和棉花为研究对象，对次要农做物的转基因筛查办法停止了阐发研究。
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玉米种子直达基因成分筛查战略
1.1 玉米的转基因做物研发妥帖情状
玉米属于禾本科玉米属，起源于中南美洲热带和亚热带高原地域，在我国已有400多年的种植汗青。玉米的贸易化转基因玉米转化体有27个，次要分抗虫和耐除草剂两品种型。我国目前颁布了部门转基因玉米的平安证书，但是未批准转基因玉米贸易化种植。进口的国外转基因玉米也只能用做加工原料。截至2021岁尾，获准做为加工原料进口到中国的转基因玉米转化体有15个，别离是1个耐旱玉米MON87460，1个品种改进玉米Event3272，3个耐除草剂玉米GA21、T25、NK603，6个抗虫耐除草剂玉米TC1507、Bt11、Bt176、MON88017、59122、Bt11×GA21，4个抗虫玉米MIR604、MON89034、MIR162、MON810。转基因玉米的研究标的目的有抗虫、耐除草剂、营养高效、高产等优良性状的研究。
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1.2 玉米的转基因转化体阐发
玉米有27个转基因转化体，多样的转基因转化体增加了对玉米直达基因成分筛查的难度。根据转基因检测数据库（GMDD，次。
1.3 玉米的转基因筛查战略
在表1的27个玉米转化体中，有23个转化体含有CaMV 35S启动子。不含有CaMV 35S启动子的4个转化体中都含有NOS末行子。那阐明，同时停止CaMV 35S启动子和NOS末行子检测，能够笼盖所有的27个玉米转化体。用那两个元件对27个转化体停止分类，同时含有CaMV 35S启动子和NOS末行子的转化体有13个，只含有CaMV 35S启动子的转化体有10个，只含有NOS末行子的转化体有4个。因而，结合利用CaMV 35S启动子和NOS末行子，可实现对玉米种子转基因成分的筛查检测。
1.4 玉米的转基因成分检测道路图
在对大量玉米样品停止转基因检测时，起首结合利用CaMV 35S启动子和NOS末行子停止筛查，然后根据筛查成果，根据图1停止转化体的进一步阐发和确定。图1中镂空箭头表达挑选的道路，实线箭头表达对应的挑选元件检出，虚线箭头表达对应的挑选元件未检出。假设CaMV 35S启动子和NOS末行子的检测成果都为阴性，则认为样品中未检出转基因成分。假设CaMV 35S启动子和NOS末行子的检测成果任何一个为阳性，则认为样品中检出转基因成分。关于筛查出阳性的样品，需要陆续停止其他元件的筛查，如Bar基因、CP4-EPSPS基因、pat基因、FMV 35S启动子，或者间接利用转化体特异性检测办法停止确认。
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大豆种子直达基因成分筛查战略
2.1 大豆的转基因做物研发妥帖情状
大豆是豆科大豆属一年生草本动物，在我国已有5000多年的种植汗青，目前全国分为5个大豆主产区。转基因大豆次要种植在美国、阿根廷、巴西等美洲国度，以耐除草剂大豆为主。我国目前批准了转基因大豆的平安证书，但是没有批准转基因大豆的贸易化种植。进口的国外转基因大豆只能用做加工原料。截至2022岁尾，中国批准的能够做为加工原料进口转基因大豆转化体共11个，别离为1个抗虫耐除草剂大豆MON87701×MON89788，6个耐除草剂大豆GTS40-3-2、A2704-12、CV127、A5547-127、MON87708、MON89788，1个抗虫大豆MON87701，2个操行改进大豆MON87769、305423和1个操行改进耐除草剂大豆305423×GTS40-3-2。转基因大豆的次要研发标的目的为耐除草剂、抗虫、抗病、操行改进等优良性状的研究。
2.2 大豆转基因转化体的阐发
根据刘冰等检索转基因收集数据库，构建的大豆转基因转化体信息和分子特征矩阵（表2）能够看出，表中列出的15个大豆贸易化转基因转化体中，pat基因呈现的频次更高，共计7次；花椰菜花叶病毒CaMV 35S启动子呈现了6次；然后是CP4-EPSPS基因、Bt基因、NOS末行子和FMV 35S启动子，别离是4次、3次、2次和2次。
2.3 大豆的转基因筛查战略
大豆贸易化转化体中，pat基因、花椰菜花叶病毒的CaMV 35S启动子、CP4-EPSPS基因、Bt抗虫基因4个靶标元件组合利用，能够实现对表2中的已知12个大豆转化体的转基因筛查检测。其他3个转化体DP-305423、DP356043和BPS-CV127-9，可利用专门的转化体特异性检测办法停止零丁检测。
2.4 大豆的转基因成分检测道路图
在对大量大豆样品停止转基因检测时，根据CaMV 35S启动子、pat基因、CP4-EPSPS基因、Bt基因和转化体特异性检测的挨次停止筛查，如图2所示。假设CaMV 35S启动子、pat基因、CP4-EPSPS基因、Bt基因和转化体特异性检测成果都为阴性，则认为样品中未检出转基因成分。假设CaMV 35S启动子、pat基因、CP4-EPSPS基因、Bt基因和转化体特异性检测成果任何一个为阳性，则认为样品中检出转基因成分。
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水稻种子直达基因成分筛查战略
3.1 水稻的转基因做物研发妥帖情状
水稻是禾本科稻属一年生培育提拔做物，在我国有悠久的种植汗青，次要品种有籼稻和粳稻两种。美国最早在2009年批准耐除草剂转基因水稻的贸易化种植。我国在2009年批准了2种抗虫转基因水稻消费利用平安证书，但目前并没有贸易化种植。转cry1Ab、cry1Ac抗虫基因水稻华恢1号及其Bt汕优63杂交种，是抗鳞翅目害虫的转基因水稻品系，外源基因表达产品能够掌握二化螟、三化螟和稻纵卷叶螟等水稻鳞翅目害虫，削减杀虫剂的利用。富含β-胡萝卜素的转基因黄金大米是一种操行改进水稻，β-胡萝卜素可在人体内转化为维生素A，填补体内欠缺的维生素A，从而削减贫苦地域儿童夜盲症和失明的发病率。目前转基因水稻的研究标的目的是抗病、抗虫、耐除草剂等的研究。
3.2 水稻转基因转化体阐发和筛查战略
目前已知的水稻转化体包罗转cry1Ab/cry1Ac基因抗虫水稻华恢1号、Bt汕优63，转pat基因耐除草剂水稻LLRICE601、LLRICE06，代谢路子调剂的转基因黄金大米转进的基因包罗psy基因、SSUcrtI基因和hpt基因。根据转基因检测数据库、欧洲转基因生物指南和美国情况风险评估中心转基因做物数据库，抗虫水稻Bt汕优63和除草剂水稻LLRICE601、LLRICE06都利用了CaMV 35S启动子，而抗虫水稻华恢1号和Bt汕优63、耐除草剂水稻LLRICE601、转基因黄金大米都利用了NOS末行子。由此看出，合并利用花椰菜花叶病毒CaMV 35S启动子和NOS末行子，可实现对水稻中已知的转化体停止筛查检测。为了避免研发阶段或未公开的水稻转化体不法扩散，可对水稻种子同时结合cry1Ab/cry1Ac基因、pat基因停止筛查。
3.3 水稻转基因成分检测道路图
在对大量水稻样品停止转基因检测时，根据CaMV 35S启动子、NOS末行子、cry1Ab/cry1Ac基因、pat基因停止筛查，然后根据筛查成果，根据图3停止转化体的进一步阐发和确定。假设CaMV 35S启动子、NOS末行子、cry1Ab/cry1Ac基因和pat基因等元件的检测成果都为阴性，则表白样品中未检出已知的转基因转化体。假设CaMV 35S启动子、cry1Ab/cry1Ac基因、NOS末行子和pat基因等元件的检测成果任何一个为阳性，则认为样品中检出转基因成分。
假设检出CaMV 35S启动子、NOS末行子、cry1Ab/cry1Ac基因，可能含有华恢1号转化体；检出NOS末行子、cry1Ab/cry1Ac基因，则可能含有Bt汕优63转化体；检出CaMV 35S启动子、NOS末行子、pat基因，可能含有LLRICE601转化体；检出CaMV 35S启动子、pat基因，可能含有LLRICE06转化体；只检出NOS末行子，可能含有黄金大米转化体；检出CaMV 35S启动子、NOS末行子、cry1Ab/cry1Ac基因、pat基因中任一个，而未检出上述转化体，则可能含有研发阶段或未公开的水稻转化体。
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棉花种子直达基因成分筛查战略
4.1 棉花的转基因做物研发妥帖情状
棉花为锦葵科棉属一年生双子叶动物。全球转基因棉花的种植面积仅次于大豆和玉米，位列第三，次要种植在美国、阿根廷、巴西等国。我国2015年转基因抗虫棉种植面积为333.3万hm²（5000万亩），占全国棉田面积的93%，此中国产抗虫棉占95%以上。我国仍是全球更大的棉花进口国，截至2022岁尾，获准做为加工原料进口到中国的转基因棉花转化体有11个，别离为5个抗虫棉花15985、COT102、531、DAS-24236-5和DAS-21023-5，4个抗除草剂棉花LLCotton25、GHB614、MON88913和1445，2个抗虫耐除草剂棉花GHB119和T304-40。目前转基因棉花的研究标的目的是抗病虫、抗旱、耐除草剂、耐盐碱和操行改进等优良性状的研究。
4.2 棉花的转基因转化体阐发
根据转基因检测数据库、欧洲转基因生物指南和美国情况风险评估中心转基因做物数据库，以转基因棉花转化体为行，以常用基因元件为列，构成转基因棉花转化体信息和分子特征矩阵（表3）。在表3中的13个棉花转化体中，呈现频次更高的元件是CaMV 35S启动子，呈现10次；其次是NOS末行子，呈现9次；之后是Bt基因6次；Bar基因和CP4-EPSPS基因3次；FMV 35S启动子2次。
4.3 棉花的转基因筛查战略
在表3的13个棉花转化体中，有10个转化体含有CaMV 35S启动子。不含有CaMV 35S启动子的3个转化体中有2个含有NOS末行子（COT102和COT67B），1个含有CP4-EPSPS基因（GHB614）。那阐明，同时停止CaMV 35S启动子、NOS末行子和CP4-EPSPS基因检测，能够笼盖所有的13个棉花转化体。
因为我国批准的转基因平安评判证书中棉花做物都是转cry1Ab/cry1Ac基因或转cry1Ac基因抗虫棉，因而，利用Bt基因可实现对国内棉花的高效率筛查。考虑到以上两点，同时停止CaMV 35S启动子、NOS末行子、CP4-EPSPS基因和Bt基因检测，能够笼盖国表里所有的棉花转化体。
4.4 棉花的转基因成分检测道路图
在对大量棉把戏品停止转基因检测时，根据CaMV 35S启动子、NOS末行子、CP4-EPSPS基因和Bt基因的挨次停止筛查，如图4所示。假设CaMV 35S启动子、NOS末行子、CP4-EPSPS基因和Bt基因检测成果都为阴性，则认为样品中未检出转基因成分。假设CaMV 35S启动子、NOS末行子、CP4-EPSPS基因和Bt基因检测成果任何一个为阳性，则认为样品中检出转基因成分。
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小麦种子直达基因成分筛查战略
5.1 小麦的转基因做物研发妥帖情状
小麦是禾本科票据叶动物，起源于亚洲西部。美国2004年批准了耐除草剂转基因小麦MON71800的贸易化种植，但截至目前种植面积很小。我国的转基因小麦处于研发阶段，目前没有批准任何转基因小麦的平安评判证书。目前转基因小麦的研究标的目的是抗病、抗旱、耐除草剂和氮高效操纵等优良性状的研究。
5.2 小麦的转基因转化体阐发和筛查战略
小麦是我国北方的主粮，我国目前没有批准转基因小麦的平安证书和贸易化种植。针对小麦转基因的监管，其重点一是避免尝试室停止试验研究的转基因小麦违规扩散，二是避免进口小麦中稠浊的转基因小麦。转基因耐除草剂小麦MON71800转进的基因有CaMV 35S启动子、NOS末行子和CP4-EPSPS基因，而Bar基因也是耐除草剂小麦研发中经常利用的基因元件。因而，结合利用CaMV 35S启动子、NOS末行子、CP4-EPSPS基因和Bar基因，可实现对转基因小麦种子的筛查。
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总结
我国转基因做物的开展方针为斗胆研究，慎重妥帖，目前只批准了棉花和木瓜的贸易化种植。我国将根据非食用、间接食用、食用的道路图推进转基因做物的财产化。转基因财产化在我国将成为趋向。
跟着我国转基因财产的逐渐开展以及消费者对转基因食物的继续存眷，农做物种子的监管将有效按捺违规转基因进进消费市场。因而，成立快速、准确、低成本的转基因成分筛查检测办法，可以为我国转基因监管供给有力的手艺支持。本研究针对我国次要农做物种子的转基因成分检测，提出了快速、准确和低成本的筛查办法，可实现对5种次要农做物种子的大量样品停止低成本、高效率的转基因成分筛查检测。