陈东科：做微生物查验，用好摄影手艺很重要

做者：查验视界

临床尝试室

本文刊载于《临床尝试室》杂志2023年2月刊“临床查验”

专题-「尝试室诊断手艺导航」版块 做者：陈东科 单元：海南省，三亚市人民病院/四川大学华西三亚病院查验科

医学微生物学是一门与临床密切相关的学科，也是查验医学重要的一部门。跟着主动化微生物判定仪、量谱阐发仪和分子生物学等办法在临床微生物尝试室的普及和利用，为微生物查验工做者对病原微生物的快速诊断和药敏试验供给了有力东西，但至今尚无一个判定系统能包罗所有的微生物判定材料和信息。没有完美的办法学，需要多个办法学参考验证。微生物的形态、染色以及特殊构造是最根本的分类根据，通过各类判定系统得出的成果，必需与已获得的生物学性状(如标原来源、菌体形态及染色性、菌落特征及其他的心理生化特征）停止查对，才气制止错误判定的发作。

形态学查验在临床微生物查验工做中的重要性

形态学查验对微生物判定具有导航的感化，准确的形态学查验成果是准确判定细菌(实菌)的坚实根底。做为根本功的形态学常识，是每一位微生物查验手艺人员必需掌握的技能。在现实工做中微生物形态学图片的用处十分普遍，如临床涂片陈述(图文陈述)、判定仪器的专家系统、室间量量评判、教学、材料保留、进修交换、颁发论文、编纂图谱等都需要清晰的图片。因而，学会拍摄微生物图片也成为了临床微生物查验人员需要掌握的技能之一。

临床微生物查验摄影的范围

临床微生物查验摄影是指对由各类微生物引起传染性疾病的相关图片拍摄，次要拍摄范畴包罗患者的传染部位、标天性状、病原体(细菌、实菌、寄生虫等)、病原菌宿主、标本涂片镜检成果(染色或不染色)、菌落特征、纯菌涂片镜检成果(包罗菌体的特殊构造等)、生化反响及辅助试验成果、药敏试验及耐药机造检测的表型成果等。细菌(实菌)形态学包罗细胞形态学和菌落形态学。

拍摄前的预备工做

拍摄前需要掌握必然的形态学常识和摄影根本常识，标本涂片的造备很重要也很关键，染色手艺要过关，培育提拔基及孵育前提间接影响到对菌落形态的看察，显微放大设备(显微镜等)、摄影器材等设备是不成或缺的。

1.进修和掌握形态学常识：差别病原体有差别或附近的形态特征，即便是统一种病原体在差别情况中形态也会差别。因而，领会病原体的根本构造、分类和定名的原则，对我们准确地识别重要病原十分有搀扶帮助。相关的国表里参考书有《医学重要实菌判定指南》、《实菌病诊断与治疗》、《THE YEASTS A TAXONOMIC STUDY》、《适用临床微生物学查验与图谱》等，还有无纸化的《临床微生物学查验图谱》等。

2.标本涂片的造备：无论是染色片仍是不染色片，均要求造成单细胞层的厚度为宜。要拍出病原体在标本中的保存形态、形态特征及染色特征，造片非常重要。造片的根本原则是尽可能连结标本中组织细胞的构造不被毁坏，涂片的厚度要求是单层细胞、平均一致，如许的片子染色后整片着色平均一致、细胞核与细胞浆清晰、菌体是被吞噬或是粘附可辨，那是图片拍摄对造片的根本要求。

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3.染色手艺：差别的病原体对染料的亲和力不尽不异。根据染色液阐明书中的操做要求停止，同时用量控片停止量控，以量控片达标为准。利用主动染片机的用户应根据造片的厚薄摘用差别的法式停止染色，同时用量控片停止量控。革兰染色量控片造备：取一种革兰阳性菌和一种革兰阴性菌，例如金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌（选举用ATCC原则菌株），各设置装备摆设2麦氏浊度单元浓度的菌液，两菌液混匀后挑取一接种环涂成曲径为1.5cm的菌斑，晾干，固定后备用。其他染色办法的量控片，可选响应的阳性菌株或标本经灭活后造备。

4.菌株预备：关于细菌（实菌）形态学的准确描述依靠于办法、培育提拔基、培育提拔时间、染色试剂等，培育提拔基和培育提拔时间差别会影响细菌的形态。看察细菌(实菌)的典型形态，应该是将细菌（实菌）接种在该菌最适生长的培育提拔基上、放进该菌最适生长情况中(包罗温度、湿度和所需气体前提等)停止孵育，孵育时间应视该菌的生长速度而定，大部门常见的细菌以培育提拔24h为宜，有些细菌(实菌)需要更长时间的孵育才气闪现出典型的菌落特征。有时为了辨别某一种或某一类细菌(实菌)，需要看察细菌在特殊的培育提拔基(包罗显色培育提拔基)上或在特定情况下(气体、温度和光线等)培育提拔的形态特征。

5.显微放大设备：“微”生物，就是人们用肉眼看察时看不见的生物。我们要想办法把我们的拍摄对象放大数百上千倍，一般的相机达不到那个要求，必需借助放大设备（放大镜或显微镜）才气完成。

6.显微摄影对显微镜的要求：需要安拆图像摘集器或拍照机的用户，必需预备三目显微镜。二目或一目显微镜只适用于摘用经目镜拍摄的用户。目前多见的是三目显微镜加上一个摘集系统（如图1）。图1右侧展现的是教学显微镜，也能够投屏供多人看看。预算不敷也能够将数码相机捆到显微镜目镜长进行拍摄（如图2）。不外，更多人喜爱于手机摄影，为了生物平安考虑，能够装备一个公用手机在尝试室内利用。

图1摘集系统（左） 教学显微镜（右）

图2目镜间接拍摄

7.摄影器材：工欲善其事，必先利其器。要拍出抱负的图片，就必需有适手的摄影器材，才气到达事半功倍的效果。跟着数码时代的到来，微生物摄影如虎添翼，摄影设备有了量的飞跃，形形色色的专业设备应运而生，品种繁多。各尝试室应根据尝试室前提和经济实力购置恰当的摄影器材，更低设置装备摆设应该至少能拍出到达打印图文陈述和出书要求的图片（不小于300kb/图）。拍摄用的显微镜图像摘集系统应设置装备摆设像素不低于1000万的电子摄像头。目前市场上的数码相机像素都在1000万以上，完全适用于细菌图片的拍摄需要。一般尝试室常将显微镜下图像通过摘集设备投屏到展现器屏幕上便利多人看看（如图1右）。而病理科因玻片存储容量问题，运用图片扫描仪将玻片扫描成高清数码图片存储起来，能够随时放大查看细节，也能够标注。但是如许拍出的图片都在1G以上，需要强大的传输和贮存设备。皮肤镜的放大倍数有好几百倍，且有照明，如许的产物也适用于微生物的拍摄。笔者日常工做中拍摄利用的是一个数码相机，装备一个特殊的转接镜头，毗连到显微镜长进行拍摄。在此之前是用数码相机对着目镜停止拍摄（如图2）。

8.手机拍摄辅助器：在现实工做中，最便利的是用手机间接停止拍摄（便利交换），但是用手机拍摄显微镜下图片时碰着的更大问题是手持拍摄不不变，出格新手，挠屏困难，对焦禁绝，很难拍到契合要求的图片。手持拍摄需要必然的身手和操练，觅觅支持点，掌握要领后也能够拍出不错的图片。但现实情状不尽如人意。根据那种情状，笔者创造了一系列响应的辅助器。起初为固定手机，将纸卷成高度适宜的纸筒（差别品牌的手机对高度的要求有差别）套在目镜上，将手机摄像头抵在纸筒上增加不变性来拍摄，那种纸筒能够卷几个差别的高度和粗细适应差别的手机型号和差别型号的目镜，此纸筒被称为“第一代神器”（如图3），但是有些查验人员仍然不克不及利用它拍摄出清晰的图像。于是“第二代神器”—DongKe LENs应运而生（如图4），DongKe LENs系统包罗DongKe LENs、10*目镜、蓝牙远控器和铁片（粘在手机后背固定手机用），将手机操纵磁铁吸附在辅助器上，仅用手指即可在屏幕长进行操做（放大和摄影等），出格是拍摄动态的图片（如寄生虫）和视频时十分不变，拍摄效果清晰。利用手机拍摄辅助器是不错的抉择，从简易的纸筒辅助拍摄器开展到固定式的辅助拍摄器，如今用手机拍摄已不成问题，并且经济、操做简双方便，对下层单元是不错的抉择。“三代神器”是一种简化的高清摘集器（如图5），能够插卡、用蓝牙传送到手机上、用线路传至电脑上。

图3第一代神器

图4第二代神器DongKe LENs

图5第三代神器

9.菌落拍摄器材：菌落拍摄难度要大于镜下拍摄，出格是小菌落、凹陷菌落、扩散生长菌落、绒毛样菌落等，主动拍摄很难准确对焦，拍摄时需要运用到良多微距摄影手艺与身手，需要持久的操练才气拍摄自若。为便利拍摄，响应的拍摄安装也应运而生（如图6），良多尝试室利用的是那套设备，价格相对廉价，但无法掌握污染。为了契合生物平安要求，第四代神器（菌落拍摄公用设备）考虑到生物污染的问题，摘用密闭式拍摄箱（如图7），内置灯光，上方有孔可用于手机摄像头拍摄。而改进后的第五代神器类似于生物平安柜的款式（如图8），关上门能构成封锁的空间，手摇可调剂角度，内置紫外消毒灯。第六代神器愈加小型化（如图9），内置环形灯和可调角度的平皿收架，可多角度拍摄。第七代神器能够将平皿主动送进送出，添加软件后可撑持纸片法药敏曲径的丈量和主动判读成果。

图6市售拍摄安装

图7第四代神器

图8第五代神器

图9第六代神器

10.摄影根本常识：曝光、对焦和构图是摄影的三要素。曝光4要素：光线、光圈、快门和感光度，光线越强照片越亮堂，光圈越大越亮堂，快门越慢越亮堂，感光度越高越亮堂。光线3个特征：强度、标的目的和色温，强度是指亮不亮，标的目的是指光从哪里来，色温是指光源发射光的颜色与黑体在某一温度下辐射光色不异时，黑体的温度称为该光源的色温。光线的3个类型：天然光、场景光和人造光，天然光光谱范畴广，色彩复原更佳。场景光往往指拍摄现场合有可用的光源发出的光，光源复杂、强度较弱。人造光指人工设想造造的仪器、设备产生的光，如日光灯的光、激光等，常用的人造光设备如闪光灯。景深3要素：光圈、焦距和对焦间隔，光圈越大景深越浅，焦距越长景深越浅，对焦间隔越近景深越浅（布景越模糊）。感光度：是指胶片或感光器对光的灵敏水平，用ISO表达。感光度越高，对光线越灵敏。高感光度下的图像细节缺失形成了照片不清晰。相反，感光度低，图像噪点削减，画量细腻。

对焦是指通过改动镜头与感光器之间的间隔，让某一个特定位置的物体通过镜头的成像焦点正好落在感光器之上，得出最清晰的影像。对焦不准确，则拍摄的图片不清晰。

构图是指若何把人、景、物安放在画面傍边以获得更佳规划的办法。构图的目标是对拍摄的主题加以强调凸起。

每个尝试室至少培育提拔1~2位懂摄影的手艺人员才气更好地胜任图片搜集工做。更为深进的常识可参阅相关专业册本停止进修。

微生物图片摄影办法

关于差别的拍摄对象，要摘用差别的拍摄办法停止拍摄，拍摄身手的掌握与利用能够大幅进步图片的量量。图片的量量不单单是把拍摄对象拍清晰那么简单，要求图片能表示出被拍摄对象的特征，哪怕是细微的特征也要求表达出来，那关于菌株间的辨别可能是至关重要的。

1.传染部位拍摄：有些病原体传染人体后会产生特殊的体征，如麻风、皮肤炭疽、猩红热、葡萄球菌皮肤烫伤样综合征、麻疹、干性或气性坏疽、实菌性角膜炎、软下疳、梅毒、鹅口疮、白喉、破感冒、糠秕疹(由马拉色菌引起)、胞子丝菌病(“玫瑰手”)、黄癣(由许兰毛癣菌引起)、黑癣(由紫色毛癣菌引起)、叠瓦癣(由齐心性毛癣菌引起)、足肿病、囊虫病、血吸虫病、丝虫病等，关于辨别诊断具有批示意义。因而关于传染部位的拍摄显得非常重要。拍摄前需要对传染部位停止评估，抉择更具有代表性的部位停止拍摄。要求对焦要准确，在光线充沛的处所停止拍摄，更好是天然光，假设现场光线达不到间接拍摄的要求，可摘用辅助光停止拍摄，如台灯等可挪动灯具或是利用闪光灯，利用闪光灯要重视间隔和角度，制止曝光过度。

2.标本的间接涂片镜检成果拍摄：标本的间接涂片镜检关于传染性疾病病原的诊断有重要的意义，是一种快速、简便、有效的微生物查验手段。可为临床医生早期诊断、合理的体味选用抗菌药物供给参考根据。

（1）不染色标本拍摄：不染色标本涂片凡是是摘用间接压片的办法造片，一般只在低倍或高倍镜下看察，很少利用油镜看察。因而，调剂恰当的亮光对拍摄图片的胜利与否非常重要，将显微镜的聚光器下调到恰当位置，以获得更佳亮度，此时被拍摄对象的轮廓及条理清晰清楚（如图10）。

图10（1）图片拍摄：因为没有停止染色，病原体与布景的色差不大，需要调剂聚光器，以凸起病原体。拍摄寄生虫等较大个别时需要重视细节，寄生虫相关于实菌和细菌个头算大的，个别大于10mm可间接用微距镜头停止拍摄，但细节表示不会太好，定见在显微镜下拍摄细节部门。因为个别大、厚度高，要想用一个镜头拍摄完全虫体几乎不成能，只能分层拍摄，或是将虫体压扁后停止拍摄。要拍摄虫体器官，必需停止染色。寄生虫拍摄的重点在口器、尾器、交合器和脏器的细节，虫卵拍摄也同样要重视卵内细节，如钩虫卵的卵膜和齿、鞭虫卵的核、蛔虫卵的膜等（如图11）

图11（2）动态视频拍摄：适用于活体标本的间接镜检拍摄，如细菌运动体例、阿米巴滋养体、蓝氏贾第鞭毛虫、滴虫、纤毛柱状上皮细胞等。要求标本别致(需要时保温)，拍摄要稳(定见固定拍摄，手持拍摄不稳)，实时调焦(即跟从拍摄)

（2）染色标本拍摄：拍摄前，先对整张涂片停止看察，抉择更具代表性的视野停止拍摄，每个视野可调剂差别焦距面停止拍摄，在差别层面上反映出病原体在标本中的形态，对大小差别的拍摄对象应选用差别的物镜头停止拍摄，尽量拍出其完全性（如图12、图13）。

图12染色痰涂片 革兰染色 诺卡菌（x1000）

图13染色痰涂片 革兰染色 烟曲霉（左），六胺银染色 黄曲霉（右）

（3）菌落的拍摄：细菌和实菌在固体培育提拔基外表生长构成菌落。对菌落停止描述应包罗菌落大小(分大、中、小，菌落曲径以1mm为界)、外形、高度、边沿、外表形态、密度(通明度)、菌落内部构造、颜色、光泽以及与培育提拔基外表的黏附水平，还应包罗菌落的溶血和色素产生情状等特征。看察菌落特征的目标是为了对细菌和实菌停止初步判定。有些特征是某些细菌和实菌所特有的，具有属或种的辨别价值，如肺炎链球菌在绵羊血琼脂平板上的脐窝样菌落（如图14左）、伴放线凝固杆菌菌落特殊的内部构造、侵蚀艾肯菌的斗笠样菌落（如图14右）、斯氏假单胞菌皱纹样菌落、变形杆菌迁移样菌落，酵母型实菌、酵母样实菌、丝状实菌等。

图14肺炎链球菌脐窝样菌落（左） 侵蚀艾肯菌斗笠样菌落（右）

（4）色素拍摄：看察细菌和实菌色素的产生，更好是在没有颜色的培育提拔基长进行培育提拔，如营养琼脂、 MHA、PDA、察氏琼脂等，出格不克不及在显色培育提拔基长进行看察，以削减布景颜色对实在颜色的骚乱。拍摄前的构想很重要，要根据差别菌落特征抉择差别的拍摄办法，要求拍出菌落的次要特征和部分细节，拍出的菌落稳定形，菌落颜色要保实（如图15），要标注放大倍数制止误导读者。

图15淡色布景（左） 深色布景（右）

（5）特写镜头拍摄：对菌落部分细节的拍摄可能要借助放大镜或显微镜来完成，辅助光的利用是必需的，更好利用专业光源，也可利用台灯，但要重视颜色的保实，适时调剂白平衡(可设置成主动调剂)。为了更好的凸起菌落特征（如图16），定见抉择适宜的布景颜色(即平板放置平台的颜色)，布景颜色抉择的根本原则是深色平板(指琼脂颜色)用淡色布景，如血平板选用白色布景;淡色平板抉择深色布景，如营养琼脂平板或SDA平板等应该抉择黑色或蓝色布景。

图16诺卡菌气生菌丝（左） 戈登菌（右）

拍摄大菌落(菌落曲径1mm)时可拍全平板，拍摄小菌落(菌落曲径1mm)时更好拍摄菌落散布较平均的部分。拍摄菌落特征时可针对单个菌落停止拍摄，需要时可借助放大镜或在显微镜下拍摄。拍摄菌落内部构造时需要摘用透射光（逆光）停止拍摄。

（6）纯菌体镜下形态拍摄：细菌镜下拍摄要重视抉择菌量适中、染色优良、具有典型形态特征的视野停止拍摄，对菌体特殊构造的拍摄要求足够表现出详细特征，如龋齿罗氏菌菌体末端膨大、丹毒丝菌菌体呈长链状摆列、芽胞的外形及在菌体中的位置及染色特征等(细菌的芽胞定见在相差显微镜下间接拍摄，其效果好于芽胞染色)、细菌荚膜的厚度及着色情状、鞭毛的位置和数量等(细菌的鞭毛很细，十分考验拍摄程度，要认实对焦，不然很难拍摄胜利)。

（7）实菌镜下拍摄：实菌镜下拍摄也分为不染色和染色两种情状。不染色次要是拍摄实菌天然的生长形态，如对菌落的间接镜下拍摄、对小培育提拔的间接镜下拍摄及对假丝酵母菌血清芽管试验的镜下拍摄等（如图17）。染色标本次要是对丝状实菌乳酸酚棉蓝染色后的镜下拍摄和对非丝状实菌的革兰染色镜下拍摄。拍摄时更好抉择各类典型特征会聚在一路的视野，尽量拍摄具有特征性的视野。因为实菌个别较大，拍摄时要重视景深，抉择适宜的物镜头很重要，差别焦距面都要拍下来，可以清晰地展现菌丝、足细胞、胞子梗、囊托、分生胞子等。要拍摄出丝状实菌的典型生长形态，更好是抉择小培育提拔造片停止拍摄。

图17根酶（x100）

（8）生化反响及辅助试验成果的拍摄：生化反响及辅助试验成果的拍摄其实不比菌落的拍摄随便，根据差别的试验成果需要利用差别的拍摄手艺。如细菌动力、拉丝试验、荧光素检测、CAMP、触酶试验、紫外线吸收试验、毛发穿孔试验等，拍摄那些成果对手艺的利用也差别，如光照角度、光源等。例如生化成果要拍清晰颜色；触酶试验需拍出气泡是在菌落上产生仍是在琼脂上产生；差别的溶血体例展现准确；紫外光吸收试验：甲基杆菌在紫外灯照射时展现为黑色，其他菌例如玫瑰单胞菌不吸收紫外光不展现颜色；黏液丝尝试需要对焦到黏液丝上；好氧尝试中菌的生长体例是外表生长、污浊生长仍是沉淀生长；盐水漂浮试验要将焦距瞄准菌膜拍摄等，比力考验手艺。

（9）药敏试验及耐药机造检测成果的拍摄：拍摄需要用肉眼揣度成果的药敏试验及耐药机造检测成果时，必需可以在图片中照实反映出成果的细节部门，使读者可以根据图片也能准确断定成果。如药敏试验成果中的弱生长现象、耐药机造检测试验成果中的抑菌圈边沿试验、协同或按捺试验等（如图18）。

图18药敏试验成果

（10）病原宿主的拍摄：对宿主的准确辨认能提醒医生对病原的揣度，并停止相关检测和体味治疗，包罗病原微生物、虫豸、动物等（如图19）。

图19阴虱

微生物查验摄影身手

掌握需要的摄影身手，能够获得事半功倍的效果。

1.色彩复原准确：色彩复原指拍摄的图片展现出来后，彩色摄影画面的色彩大致上和原景物的色彩相一致。影响色彩复原的因素有相机的性能、摄影镜头的量量、光线的色温、洗印前提、印片光号、展现器量量等。

2.比例尺利用的需要性：要准确地反映被拍摄物体的实在大小，最简单有效的办法就是在图片上加比例尺。但那需要相当高的手艺。有些公用的相机及显微镜配有比例尺，一般的设备不具备。那就要求拍摄者在拍摄时重视笔录拍摄时的放大倍数，当然不但是物镜乘以目镜放大倍数那么简单，现实上还需要重视相机变焦及图片后处置时的淘汰等因素，总之要尽可能准确，并在图片中说明放大倍数，不然会误导读者。

3.光线利用的身手：摄影就是光的艺术，不会用光是拍不出好做品的。出格是对菌落的拍摄，应该根据菌落的特征以及拍摄者要反映出的效果来抉择用光，测光和逆光也是常用的手段（如图20~图22），运用好能拍是极佳的效果。例如拍摄液体里的工具需要侧光和侧逆光；拍溶血性能够用透射光（逆光）拍摄，溶血效果更明显。

4.荧光拍摄身手：荧光是激发光，亮度较高，拍摄时将亮度调剂到适宜位置再停止拍摄。

图20伴放线聚集杆菌 反射光拍摄（左） 透射光拍摄（右）

图21艾肯菌倾斜角度拍摄

图22侧逆光拍摄 芽胞杆菌（左） 青霉菌黏液珠（右）

医学微生物查验摄影重视事项

微生物摄影属于专业摄影范围，不只要掌握摄影常识，还需要领会本专业的相关常识，如许才气拍出专业特色的做品来。拍摄者的体检成果应契合医学查验从业人员的体检原则，色盲、色弱者不合适停止彩色图片的拍摄工做。

1.包管图片的量量：一张合格的图片应该是图像清晰、颜色传神、主题凸起、布景清洁、像素契合出书要求。图像清晰次要是要求焦距准确、曝光足够、防颤动，颜色传神要求拍摄辅助光接近天然光、适时调准白平衡，主题凸起就是要合理构想把更具典型特征的部位放在夺目位置、需要时加箭头指示。拍摄菌落和其他辅助试验成果时是要重视连结布景清洁，布景要制止呈现窗户、门框、桌椅等，平板后背尽量不要用记号笔写字，不然影响到菌落的颜色、溶血等特征的展现。

2.生物平安保障：所有拍摄过程均要契合尝试室生物平安要求。拍摄菌落更好在生物平安柜中停止，摄影器材不要带出尝试室，图片可通过尝试室电脑停止长途传输，也可蓝牙无线传输图片。假设利用手机停止拍摄，更好是尝试室设置装备摆设的公用手机，小我的手机严禁带进尝试室。

3.兴致培育提拔与技能操练：摄影是一门独立的学科，摄影理论常识、理论摄影拍摄、绘画根底，那三科是摄影专业必需具备的根本程度。要想拍出好做品不是简单的按快门那么简单，需要培育提拔兴致，更需要持久的技能操练。定见拍摄者日常多在天然形态下停止拍摄操练，出格是对微距拍摄的操练，如拍摄花、鸟、鱼、虫等小的景物，一是能够进步摄影的兴致，二是能够陶冶情操，三来能够将实战身手运用于现实工做中来，拍出更生动详实的做品。

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题图 | veer.com

排版 | 张宁

审校 | 方研

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