【国天然热点文献】之铁灭亡（一）

又是一年的课题申报季，教师们都已经确定本身的研究课题吗？

亲爱的宝子们，末于末于迎来了2023年啦，那一年的时间过得也太太太太快啦，2022年一年有列位宝子们的陪同，是我们继续软文输出的动力呀！！

新的一年我们也将陆续为各人输出国自热点喔，本月分享主题——铁灭亡，感兴致的教师们，快来参考进修吧，走过路过不要错过呀。

起首，我们聊聊什么是铁灭亡？

铁灭亡（Ferroptosis ）是一种铁依靠性的，区别于细胞凋亡、细胞坏死、细胞自噬的新型的细胞法式性灭亡体例。铁灭亡的次要机造是，在二价铁或酯氧合酶的感化下，催化细胞膜上高表达的不饱和脂肪酸，发作脂量过氧化，从而诱导细胞灭亡；此外，还表示为抗氧化系统（谷胱甜肽系统）的调控核心酶GPX4的降低。

接着，我们来看看铁灭亡如今的研究行情~

目前的SCI颁发情状

相信各人近几年来对铁灭亡必然都不目生，近年来铁灭亡不断都是文章颁发的一大热点，近年来研究报导都是呈一个上升的形态。

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铁灭亡

目前国天然课题的立项情状

铁灭亡是目前相关研究的热点之一。从国天然历年立项情状来看，铁灭亡在立项数目和帮助金额上均闪现稳步上升的趋向，就目前来看铁灭亡的研究仍然是个研究热点。

今天给各人介绍文献的标题问题是：

Hypoxia-induced HIF-1α/lncRNA-PMAN inhibits ferroptosis by promoting the cytoplasmic translocation of ELAVL1 in peritoneal dissemination from gastric cancer.

那篇是2022年在Redox Biology期刊上颁发（IF=10.787）的一篇文章。该文章次要阐了然HIF-1α/PMAN/ELAVL1在胃癌细胞铁灭亡中的感化为GC中PM的潜在诊断生物标记物和治疗靶点供给了理论撑持。

Figure 1 HIF-1 α以腹腔转移促进胃癌中PMAN反常高表达

RT-qPCR、WB、IHC检测阐发胃癌（GC）和成对相邻一般组织(ANT)以及来自GC的ANT，初级GC和腹腔转移（PM）样本中的HIF-1 mRNA和卵白表达情状，成果表白，与GC和ANT比拟，HIF-1 mRNA和卵白量在PM中显著升高。同样，成果表白，与ANT比拟，HIF-1在GC中的表达显著升高(图1A-D)。

为了摸索促进PM的lncRNA及其被HIF-1α激活的情状，在PM和婚配的原代GC 中停止了lncRNA微阵列阐发(图1E)，并在si HIF-1α AGS细胞中停止了lncRNA文库构建/lncRNA-seq(图1F)。连系了lncRNA微阵列阐发和lncRNA文库构建/lncRNA-seq的成果，发现LncRNA-AK058030（即为PMAN）在PM中高表达，并受HIF-1α的调控(图1G)。通过Kaplan-Meier阐发，发现PMAN的高表达与GC总保存率较差存在相关性，那表白PMAN可能是PM的潜在生物标记物（图1H）。高表达PMAN组66.7%的患者术后发作PM，低表达PMAN组仅20%的患者术后发作PM，PMAN不只在GC的PM中高度表达，并且与GC患者中PM的发作呈正相关（图1I）。通过RT-qPCR验证发现，PMAN在胃癌肿瘤组织中高表达，出格在PM模子中高表达（图1J-K）。皮尔逊相关系数展现肿瘤中的PMAN和HIF-1 a mRNA呈正相关（图1L）。

综上成果表白，PMAN可能是PM的潜在生物标记物。

Figure 2 缺氧时PMAN被HIF-1α升高

成立体外缺氧模子（1%O2，5%CO2，37℃），发如今缺氧下PMAN以时间依靠性和浓度依靠性的体例升高（图2A-C）。FISH成果表白，与常氧情况比拟，低氧情况能够刺激PMAN的表达，将si HIF-1α转染到体外缺氧的GC细胞中，RT-qPCR和FISH成果均提醒si HIF-1α在缺氧期间降低PMAN表达（图2D-F）。通过火析JASPAR数据库，揣测了PMAN启动子区的HRE序列（图2G）。进一步通过荧光素酶陈述检测，发现荧光素酶活性因缺氧而显著增加，此中HRE突变体表示出明显的荧光素酶活性降低，si HIF-1α逆转了缺氧介导的WT-PMAN荧光素酶活性的促进（图2I）。CHIP尝试进一步证明HIF-1α与PMAN启动子内源性HRE位点的间接连系（图2J）。

综上成果表白，HIF-1α能够在缺氧期间在转录程度诱导PMAN。

Figure 3 PMAN可按捺GC细胞中的铁灭亡

起首用Erastin（10 μM）或RSL3（2μM，刺激铁灭亡的药物）处置AGS细胞12h，看察细胞形态发现，用Erastin或RSL3治疗后，细胞失往一般外形，变得萎缩（图3A）。此外，用透射电子显微镜(TEM)评估细胞线粒体的改变，成果展现Erastin或RSL3处置后线粒体变小，膜密度增高，嵴削减（图3B）。进一步利用含有LV-PMAN的慢病毒载体构建了不变的PMAN-OE（过表达）MGC-803细胞，通过RT-qPCR成果展现PMAN表达显著增加（图3C）。CCK-8成果表白PMAN-OE增加了MGC-803细胞的活力（图3D）。PMAN-OE在用Erastin或RSL3处置后显著降低了MGC-803细胞的细胞内Fe、Fe2+、脂量ROS、MDA和GSSG/GSH比值（图3E-I）。TEM阐发表白，PMAN-OE处置后MGC-803细胞中改动的线粒体超微构造恢复（图3J），上述成果表白，PMAN-OE促进MGC-803细胞对铁灭亡的对抗。

用慢病毒PMAN shRNA转染AGS细胞，与空白比照比拟，敲降PMAN后，细胞中PMAN表达显著降低，表白敲降胜利（图3K）。CCK-8试验表白，PMAN-SH显著降低了AGS细胞的增殖才能（图3L）。用Erastin或RSL3处置后，PMAN-SH增加了AGS细胞的细胞内Fe、Fe2+、脂量ROS、MDA和GSSG/GSH比值（图3M-Q）。TEM在PMAN-SH AGS细胞中发现线粒体呈现严峻干瘦（图3R）。

综上成果表白，敲降PMAN增加了AGS细胞对铁灭亡的灵敏性。

Figure 4 PMAN促进SLC7A11的mRNA不变性

起首通过WB、IHC和RT-qPCR检测了PMAN-SH细胞和PMAN-OE MGC-803细胞中铁灭亡相关基因的卵白量和mRNA程度。成果表白，SLC7A11 mRNA和卵白量的表达在两个细胞系之间有显著差别，而其他铁灭亡相关基因如GPX4，ACSL4和FTH1在mRNA程度上被PMAN-SH/OE显著改动，但在卵白量程度上没有显著改动（图4A-E），上述成果表白SLC7A11在PM中高于GC和ANT。

Pearson相关系数表白，PMAN与肿瘤中SLC7A11 mRNA程度呈正相关（图4F）。FISH和核量RNA别离展现PMAN次要定位在细胞核中（图4G-H）。MGC-803细胞与放线菌酮(10 M)共培育提拔，PMAN-OE不改动SLC7A11的半衰期（图4I）。将PMAN-SH AGS和PMAN-OE MGC-803细胞表露于放线菌素D (AD，5 μg/ml)， 停止RT-qPCR检测，成果展现SLC7A11 mRNA的半衰期在PMAN-OE MGC-803细胞中增加，而在PMAN-SH AGS细胞中削减（图4J-K）。

综上成果表白，PMAN通过影响SLC7A11 mRNA不变性来调剂SLC7A11的表达。

Figure 5 PMAN通过与ELAVL1间接连系促进ELAVL1细胞量转位

RNA pull down和银染色尝试发现PMAN中存在的卵白量带位于大约37 kD的位置（图5A）。通过量谱阐发和WB检测，成果在PMAN中发现了许多ELAVL1连系位点（图5 B-C）。RIP成果展现，与anti-IgG IP比拟，anti-ELAVL1 IP中的PMAN显著富集(图5D)。根据ELAVL1连系位点的散布构建了三个差别的PMAN缺失片段(图5E)，并停止RNA pull down尝试，成果表白ELAVL1与PMAN的片段#1彼此感化，而与其他片段不存在彼此感化(图5F)。WB和免疫荧光成果表白，PMAN-OE组在细胞量中的ELAVL1富集显著增加，PMAN-SH则有相反的成果（图5G-J）。在低氧和常氧前提下，RIP尝试成果表白，PMAN和ELAVL1的间接连系次要位于细胞核内。与IgG比拟，PMAN在低氧前提下的细胞核富集程度较常氧降低，揣度与低氧促进ELAVL1细胞量转位有关(图5K)。

综上成果表白，PMAN能够通过间接连系来诱导ELAVL1在细胞量中定位。

Figure 6 ELAVL1是PMAN调控SLC7A11 mRNA不变性的关键RBP

RIP成果表白，与anti-IgG IP比拟，anti-ELAVL1 IP中有显著的SLC7A11 mRNA富集（图6A）。提取低氧或常氧处置的MGC-803细胞的胞量成分，通过RIP成果展现，与常氧比拟，低氧增加了胞量ELAVL1 中SLC7A11 mRNA的富集程度（图6B）。WB阐发了SLC7A11 mRNA 5‘-UTR/CDS/3’-UTR/LacZ特异性样品下拉的卵白量，成果证明SLC7A11 mRNA 3‘-UTR在ELAVL1中显著富集（图6C）。将含有SLC7A11 mRNA 3'-UTR的荧光素酶陈述量粒(图6D)，转染到细胞中发现PMAN-OE增加了荧光素酶活性，而PMAN-SH按捺了荧光素酶活性(图6E-F)。此外，si-ELAVLl按捺了PMAN-OE诱导的荧光素酶活性，而ELAVL1-OE显著进步了荧光素酶活性，PMAN-SH则按捺了荧光素酶活性(图6G-H)。接下来停止了放线菌素D尝试，成果展现在PMAN-OE 的MGC-803细胞中，si-ELAVLI缩短了SLC7A11 mRNA的半衰期，PMAN-SH的 AGS细胞中ELAVLI-OE增加了SLC7A11 mRNA的半衰期(图6I-J)。WB成果表白，ELAVLl显著影响SLC7A11卵白表达程度(图6K)。在PMAN-OE的MGC-803细胞中再加进si-ELAVL1显著增加Fe、Fe2+、脂量ROS、MDA程度，细胞内GSH程度降低，通过透射电镜看察到线粒体变小(图6L-Q)。

综上成果表白，ELAVLl能够间接连系SLC7A11 mRNA 3'-UTR的AREs，从而进步SLC7A11 mRNA的不变性和表达。

Figure 7 PMAN是HIF-1 α调剂ELAVL1细胞量易位和SLC7A11在缺氧中表达的关键

RT-qPCR和WB成果表白HIF-1α增加了SLC7A11的表达（图7A-B）。此外，si-HIF-1α显著降低GC细胞中的SLC7A11 mRNA程度（图7C）。相关性阐发成果展现，SLC7All mRNA和HIF-la mRNA在肿瘤中的表达呈正相关（图7D）。WB成果展现，PMAN恢复了si-HIF-1α降低的SLC7All的表达。同时，si-ELAVL1显著按捺SLC7A11表达，PMAN逆转了那一按捺造用（图7E）。当细胞在缺氧和一般形态下表露于AD时，缺氧增加SLC7A11 mRNA不变性，缺氧下的si-HIF-1α加速SLC7A11 mRNA的衰减速度，PMAN-OE缓解衰减速度（图7F-G）。WB和IF成果表白，缺氧增加了依靠于HIF-1α的细胞量中ELAVLl的程度，PMAN-OE逆转了si-HIF-1α后细胞量中ELAVLl的程度(图7H-I)。

综上成果表白，HIF-1α/PMAN通过促进ELAVL1的胞量易位和SLC7A11的表达来加强胃癌细胞的铁灭亡对抗。

Figure 8 PMAN促进了肿瘤在体内的发作和开展

MGC-803细胞(1× 107)中构建不变的PMAN- oe /NC，皮下或腹腔打针到4周龄BALB/c裸雌性小鼠的每侧。4周后发现，与NC组比拟，PMAN-OE组的皮下异种移植瘤和腹腔播散瘤的大小和体积显著增加(图8A-D，H)。为验证PMAN能够促进胃癌腹膜转移，搜集并悬浮了不变的PMAN- oe /NC的MGC-803细胞(5 × 106细胞)，在40 μl无血清培育提拔基中，在胃大弯的浆膜下打针(图8E)，成果发现PMAN-OE组不只有更高的腹腔内转移发作率，并且播散范畴更广(图8F-G)。RT-qPCR、WB和IHC的成果表白，PMAN-OE显著增加了体内SLC7A11的程度(图8I-N)。

综上成果表白，PMAN在体内促进肿瘤的发作和开展。

总的来说本文章的研究机造就是：

HIF-1α的表达在缺氧前提下被上调，其可做为一种转录因子，通过与PMAN的启动子序列HRE连系来激活PMAN的表达。PMAN间接连系ELAVL1，改动ELAVL1的细胞量易位。ELAVL1间接连系SLC7A11 mRNA的(GUUU)位点，进步其mRNA的不变性，加强SLC7A11的表达。肿瘤细胞能够将Cys（胱氨酸）运输到细胞内，通过SLC7A11的过度表达将其复原为半胱氨酸，并参与谷胱甜肽（GSH）的合成，削减ROS和铁在肿瘤细胞中的积存和线粒体的毁坏，按捺铁灭亡的发作，从而促进了肿瘤细胞的生长。

看到那是不是发现我们的课题就做（du）完了，看着是不是超等简单？？那篇文章整体是一个相对常规传统的机造研究，其大致的研究大致道路办法，能够借鉴到此外研究中哦！

下篇我们再正式拆解一篇高分的铁灭亡机造研究的计划套路~

假设你感兴致的话，就戳个存眷吧~

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